光转换荧光蛋白的光激活荧光蛋白PA-GFP

为光活化研究设计的第一个光学指示剂是维多利亚水母的一种蛋白质突变体，称为PA-GFP(分别取photo和activatable的首字母)。这种GFP蛋白的光活化突变体是通过将野生型中性蛋白转化为阴离子状态而获得的。在未受干扰的状态下，野生型绿色荧光蛋白分别在395 nm和475nm处有两个吸收峰。当蛋白质受到强紫外光或紫光照射时，发色团产生光转换，从而改变两个吸收峰的相对消光系数之比。结果表明，在488nm处发射的荧光强度是激发前的3倍。

从上到下分别是FRAP、FLIP、光激活。

通过突变技术得到的PA-GFP降低了475nm处的吸收峰，在450~550nm处的吸收几乎可以忽略，同时提高了近紫外(约400nm)照射下野生型光的转换效率。从而大大增加了非激活和激活状态之间的对比度。光活化后，PA-GFP在504nm处的最大吸收增加了约100倍。这一现象大大增强了转化和未转化PA-GFP的差异，从而最终观察到其在细胞内的动态变化。

显示了光活化前后PA-GFP的吸收和发射峰曲线。图中表示用于光转换的激光波长(箭头)和宽视场弧光灯的激发波段(黄框)。图3a中的激活荧光发射曲线是在488nm激光激发下获得的。如图3b所示，目标位置可以被405nm固态激光器激发。光激活后，绿色荧光的强度会明显增加，如图3c所示。

PA-GFP的光活化可用于标记选定的分子或整个细胞，并可通过使用延时成像技术获得动力学特征。在理想状态下，只有被激活的PA-GFP分子发出醒目的荧光，新合成的蛋白质不会影响实验。PA-GFP的光活化比GFP的光漂白更快、更明显，用于光活化的激光强度远小于FRAP的漂白激光，细胞杀伤也相对较低。因此，该技术非常适合于活细胞中蛋白质的动态研究。

然而，应该注意的是，在光转化后，PA-GFP和野生型GFP在488nm的激发下显示出相同水平的增强。另一方面，在光诱导(如405nm激发)之前，很难区分细胞是否表达PA-GFP，因此很难用显微镜预先确定准确的表达区域。